A regulación da biosíntesis de hemo en kluyveromyces lactis: regulación trascripcional dos xenes k1hem1, k1hem12 e análise...

Título: A regulación da biosíntesis de hemo en kluyveromyces lactis: regulación trascripcional dos xenes k1hem1, k1hem12 e análise comparativa dos factores reguladores hap1p e srb10p en levadurasla regulación de la biosíntesis de hemo en kluyveromyces lactis: regulación trascripcional de los genes k1hem1, k1hem12 e análise comparativo dos factores reguladores hap1p y srb10p en levaduras

Autor/a: Laura Nuñez Naveira

Centro de lectura: 610 - Facultade De Ciencias

Data Lectura: 11 Xul 2005

Departamento: 102 - Bioloxía Celular E Molecular

Kluyveromyces lactis es una levadura de elevado interés biotecnológico que se diferencia de la levadura tradicional de estudio saccharomyces cerevisiae en diversos aspectos de su metabolismo. Mientras que en condiciones de aerobiosis y con glucosa como fuente de carbono k. Lactis posee un metabolismo fundamentalmente respirativo, s. Cervisiae lo tiene fermentativo en el mismo contexto. Estas diferencias metabólicas podrían ser el reflejo de una diferente regulación transcripcional de aquellos genes relacionados con la respiración en estos organismos tan próximos evolutivamente. En la presente tesis se estudiaron una serie de genes que se consideran fundamentales en este aspecto. Schem1 y schem12 codifican respectivamente la deltaaminolevulinato sintasa y la uroprofirinógeno descarboxilasa que catalizan el primer y quinto paso de la ruta de biosíntesis de hemo. Este grupo estructural de hemoproteínas como los citocromos, que participan en los procesos de respiración. Schap1 codifica un factor trascripcional activado por hemo que regula la expresión de genes relacionados con la respiración, y además activa la expresión de scrox1 que reprime genes hipóxicos en condiciones aeróbicas. Scsrb10 codifica una quinasa que participa en procesos tanto de activación como de represión trascripcional. En estos últimos se caracteriza por interaccionar con el complejo represor ssn6-tup1p tras ser reclutado hacia las regiones promotoras de los genes por diversos factores represores, entre los que se encuentra la proteína rox1p. En este trabajo se han clonado los genes k1hem12, k1srb10 y k1hap1 demostrando para los dos primeros su funcionalidad mediante complementación de mutaciones en genes homólogos en s. Cerevisiae. K1hap1 no ha demostrado ser funcional en s.cerevisiae al menos bajo control de su propio promotor. La expresión k1hem12 ha resultado dependiente de cepa, además de sugrir una activación por fuente de carbono no fermentable mediante la participación del factor regulador hap2/3/4/5p. El promotor puede considerarse como tata-less con múltiples sitios de inicio de la trascripción sin preferencia definida por ninguno de ellos. Mediante análisis de primer extensión se han localizado diversos puntos de inicio del promotor de k1hem1, siendo el de la posición -48 predominante. Se ha verificado la importancia del elemento rico en pirimidinas por ensayos de deleciones y mutagénesis dirigida hacia regiones concretas del promotor fusionado a lacz. Este elemento es responsable de determinar elevados niveles de expresión tanto en condiciones aerobias como anaerobias. El sitio cis para la unión de gcr1p tiene un efecto represor en medios con glucosa al 2% y el consenso para la unión de buf1p, que en el promotor del gen homólogo de s. Cerevisiae tiene un efecto represor, no muestra un claro papel regulador ni en condiciones aeróbicas ni hipóxicas. En la región situada entre las posiciones -558 a -443 se localiza una señal necesaria para la expresión hipóxica y la respuesta a hemo. Mediante alineamientos de k1srb10p con otras proteín-quinasas relacionadas se pudo observar que en levaduras existían una serie de motivos altamente conservados. La funcionalidad de estos motivos se comprobó mediante deleciones de cada uno de ellos, tanto sobre la proteína srb10p de k. Lactis como sobre la de s. Cerevisiae. Los motivos dc-i y dc-ii y el motivo de unión a atp son esenciales para la función de srb10p in vivo como queda demostrado por los efectos de su delección sobre los fenotipos asociados y sobre la expresión trancripcional de los genes flo11, cyc7 y spi1. También se ha comprobado su participación directa o indirecta en la interacción entre la quinasa y su ciclina srb1p, así como para la interacción con el represor tup1p. Otro motivo también conservado, dc-ala, cercano al extremo carboxilo terminalk, carece de relavancia funcional en la interacción con srb11p, aunque tiene cierta influencia en la interacción con tup1p. El motivo wrky, únicamente presente en la proteína de k. Lactis y cercano al extremo amino, no parece esencial en los fenotipos e interacciones analizados.

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Áreas: Ciencias Experimentais,Universidade da Coruña