Caracterización molecular de los sistemas de transporte de hierro en Photobacterium damselae, análisis de la variabilidad genéti

Título: Caracterización molecular de los sistemas de transporte de hierro en Photobacterium damselae, análisis de la variabilidad genética y presencia de elementos móviles.

Autor/a: Sandra María Juíz Río

Centro de lectura: Facultade de FARMACIA

Data Lectura: 3 Abr 2006

Departamento: Depto. de MICROBIOLOXÍA E PARASITOLOXÍA

Photobacterium damselae é unha ?-proteobacteria pertencente á familia Vibrionaceae e que actualmente engloba a dúas subespecies: P. damselae subsp. piscicida (axente causal da pasteurelose en peixes) e P. damselae subsp. damselae. Se ben nos últimos anos producíronse avances importantes no coñecemento da bioloxía deste patóxeno, as bases xenéticas da virulencia así como a diversidade xenética intraespecífica constitúen aspectos aínda moi pouco estudados. Entre os obxectivos da presente Tese nos plantexamos caracterizar xenéticamente algúns dos factores que contribúen á virulencia de P. damselae subsp. piscicida, con especial énfase nos sistemas de adquisición de ferro. Asimesmo, analizamos a diversidade xenética existente entre cepas desta subespecie, e determinamos algunhas das diverxencias xenéticas entre cepas nas dúas subespecies de P. damselae. Como punto de partida identificamos en primeiro lugar o xen que codifica a proteína Fur (ferric uptake regulator), e a súa secuencia amosou unha homoloxía do 99,3% entre as dúas subespecies de P. damselae, diferenciandose a proteína nun único aminoácido dos 148 de que consta. Ademais, demostramos que Fur actúa en P. damselae como un regulador transcripcional dependente das concentracións de ferro do medio. Por outra parte identificouse e caracterizado un sistema de captación de grupos hemo como fonte de ferro nas dúas subespecies de P. damselae composto polas proteínas HutA, TonBExbBD, HutBCD e HutWXZ. Dito sistema amosou unha elevada similitude coas proteínas dos sistemas de captación de hemo doutros membros da familia Vibrionaceae, e unha identidade próxima ó 100% entre ambas subespecies. Sen embargo, detectamos indicios de microevolución intraespecífica neste sistema: o xen do receptor de membrana externa hutA atópase interrompido constituíndo un pseudoxen en moitas das cepas de piscicida. Curiosamente, as únicas cepas da subsp. piscicida que posúen o xen hutA intacto constitúen unha posible liña clonal de illados procedentes de Xapón. O sistema de captación de hemo exprésase in vivo durante a infección de P. damselae subsp. piscicida en rodaballo, tal e como se desprende do análise da presenza de mRNA do operón tonBexbBexbBhutBCD en mostras de peixes infectados. Asimesmo, demostrouse que non existen sistemas redundantes para captar hemo, dado que a inactivación de hutCD conleva á incapacidade de utilizar grupos hemo como única fonte de ferro. Aplicando a técnica de Hibridación Sustractiva, identificamos 21 rexións do xenoma específicas dunha cepa virulenta de piscicida, e que estaban ausentes nunha cepa avirulenta. Ó estuda-la distribución destas rexións de DNA en 28 cepas de P. damselae subsp. piscicida, con diferentes orixes xeográficos e illados de diferentes hospedadores, puídose constatar que este é un microorganismo moi heteroxéneo dende o punto de vista xenético. Non se encontraron en ningún caso dúas cepas que amosasen exactamente o mesmo patrón de distribución das 21 rexións analizadas. Asimesmo, identificáronse por vez primeira neste patóxeno xenes que codifican transposasas. Estes xenes atópanse en copia múltiple, insertados no xenoma, constituíndo un patrón que resultou ser diferente en cada cepa analizada. Ademais, identificáronse nunha única cepa de piscicida secuencias xénicas similares ó elemento móbil SXT descrito en V. cholerae. Este elemento de gran tamaño (aprox 100 kb) é representativo dunha familia de transposones conxugativos e integrativos que portan xenes de resistencia múltiple a antibacterianos. Estudios previos amosaran que cada subsp. de P. damselae produce un sideróforo diferente. A aplicación da Hibridación Sustractiva para detectar diferenzas xenéticas entre as dúas subespecies posibilitou o illamento e caracterización dunha rexión do genoma de aprox. 22 kb na subsp. piscicida, que contén un operón de xenes regulados por ferro entre os que se atopa un posible receptor de membrana para sideróforos e dúas péptido-sintetasas non ribosómicas (Irp1 e Irp2) de alto peso molecular. Estas proteínas aparecen, en condicións de limitación de ferro, en preparacións de membranas totais de cepas da subsp. piscicida, estando ausentes nas cepas da subsp. damselae. A inactivación por inserción do gen irp1 fai que P. damselae subsp. piscicida non produza sideróforos e sexa incapaz de crecer en condicións de limitación de ferro. Ademais, a mutación do gen irp1 conllevó un aumento da LD50 en ó menos dous ordes de magnitude con respecto á cepa parental, demostrando que o sistema de captación de ferro mediada por sideróforos é un factor que contribúe á virulencia de P. damselae subsp. piscicida en peixes. O análise da presenza destes xenes nunha colección de cepas das dous subespecies demostrou que son exclusivos dalgunhas cepas da subsp. piscicida. Curiosamente, as secuencias aminoacídicas das proteínas codificadas por este operón amosan unha elevada similitude coas proteínas de síntesis do sideróforo yersiniabactina producido por cepas de Yersinia spp. Éstes xenes atópansese agrupados constituíndo unha isla de patoxenicidade. O análise dos dominios funcionais das proteínas Irp1 e Irp2 aportou evidencias de que o sideróforo producido por P. damselae subsp. piscicida pode estar estruturalmente relacionado coa yersiniabactina. Á vista de todo o exposto, podemos concluír que os mecanismos de captación de ferro xogan un papel importante na virulencia de P. damselae subsp. piscicida. A adquisición por transferencia horizontal de genes e/ou elementos móbiles, e a inactivación de xenes (acumulación de pseudoxenes), son procesos que probablemente contribuiron á xeración de diversidade xenética e á especiación de Photobacterium damselae.

Director/a: Manuel Lemos Ramos e Carlos Rodríguez Ososrio

Áreas: Ciencias da Saúde,Universidade de Santiago de Compostela